微生物限度檢查包含定量和定性評(píng)估，定量指需氧菌和霉菌酵母菌總數(shù)，定性則指不得含控制菌。常用方法包括常規(guī)法、靜置上清液法、培養(yǎng)基稀釋法等，其中薄膜過濾法和平皿法常用于微生物回收和計(jì)數(shù)。

中國、美國和歐洲藥典均有微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，但具體限度有所不同，分別針對(duì)不同類別產(chǎn)品制定?？傊?，微生物限度是確保產(chǎn)品質(zhì)量和安全的關(guān)鍵指標(biāo)，通過嚴(yán)格檢測(cè)和控制可有效預(yù)防微生物污染風(fēng)險(xiǎn)。

主要針對(duì)微生物限度檢驗(yàn)（薄膜過濾法）菌液的稀釋與制備、微生物計(jì)數(shù)方法學(xué)驗(yàn)證、控制菌驗(yàn)證及再驗(yàn)證等展開介紹。

驗(yàn)證用菌株及菌種要求

驗(yàn)證用菌株 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌作為細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株，需確保生物學(xué)特性穩(wěn)定，傳代次數(shù)不超過5代。

菌種保藏技術(shù) 為確保試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性，應(yīng)采用適宜的菌種保藏技術(shù)，如冷凍干燥或液氮冷凍等，并嚴(yán)格控制傳代次數(shù)。

霉菌及酵母菌驗(yàn)證 黑曲霉和白色念珠菌作為霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株，同樣需遵循生物學(xué)特性，并應(yīng)用合適的保藏技術(shù)。

需氧菌菌液制備及稀釋

細(xì)菌菌液培養(yǎng) 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌菌液制備，接種至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。

細(xì)菌稀釋 取各個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)液1ml分別加入pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10^-6~10^-7（具體稀釋級(jí)需要進(jìn)行驗(yàn)證），制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。

霉菌及酵母菌菌液制備

白色念珠菌培養(yǎng)及稀釋 接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20～25℃培養(yǎng) 24～48小時(shí)；取此培養(yǎng)液1ml加 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 9ml。采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1ml含菌數(shù) 50～100cfu的菌懸液

黑曲霉孢子懸液制備 加入3～5ml 含0.05%吐溫80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，使用渦旋儀將洗脫液進(jìn)行混勻。準(zhǔn)備一個(gè)無菌注射器內(nèi)部塞入無菌棉球，再將洗脫液進(jìn)行過濾，過濾好的菌懸液取1ml加0.9%無菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法。稀釋至10-4~10-6，制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液，為確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，所有菌液和孢子懸液的制備均需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程。

黑曲霉孢子懸液制作注意事項(xiàng)

1. 黑曲霉孢子容易污染潔凈環(huán)境，在進(jìn)行黑曲霉孢子懸液制備時(shí)建議關(guān)閉生物安全柜風(fēng)機(jī)，防止孢子擴(kuò)散。

2. 菌絲去除：確保去除菌絲，否則會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

微生物計(jì)數(shù)方法學(xué)驗(yàn)證

供試液的制備

無抑菌活性供試品 稀釋劑為pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，液體供試品需與稀釋劑按1:10比例混合均勻，固體、半固體、粘稠性供試品則按1:10比例混合稀釋劑。

培養(yǎng)基稀釋法 取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養(yǎng)基，測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)。

離心沉淀集菌法 取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補(bǔ)至原量。

薄膜過濾法 取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過濾，沖洗，按薄膜過濾法測(cè)定其菌落數(shù)，選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當(dāng)?shù)膶?duì)氨基苯甲酸，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物。

試驗(yàn)組檢測(cè)方法（無抑菌活性供試品為例）

無菌濾杯中，再加入1ml不大于100cfu的菌懸液過濾。最后再用300ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜（每次100ml，沖3次）。過濾結(jié)束后，接種金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌的濾膜貼在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）上，平行制備兩份。接種白色念珠菌和黑曲霉的濾膜貼在2個(gè)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）上和2個(gè)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)上。

菌液組檢測(cè)方法（無抑菌活性供試品為例）

取pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml加入準(zhǔn)備好濾膜的無菌濾杯中，再加入1ml不大于100cfu的菌懸液過濾。最后再用300ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜（每次100ml，沖3次）。過濾結(jié)束后，接種金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草芽孢桿菌的濾膜貼在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）上，平行制備兩份。接種白色念珠菌和黑曲霉的濾膜貼在2個(gè)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）上和2個(gè)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）上。

供試品對(duì)照組及稀釋級(jí)對(duì)照組檢測(cè)方法（無抑菌活性供試品為例）

供試品對(duì)照組 取10ml供試液過濾，再用300mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（每次100ml，沖3次），不加試驗(yàn)菌，操作同試驗(yàn)組，測(cè)供試品本底數(shù)。

稀釋劑對(duì)照組（陰性對(duì)照） 用pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10ml替代供試液，操作同試驗(yàn)組。

培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 含有銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）平板倒置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5天；含白色念珠菌、黑曲霉的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板（TSA）倒置于20~25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7天；含白色念珠菌、黑曲霉的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）平板倒置于20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7天；供試品對(duì)照組中胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，觀察結(jié)果后，延長(zhǎng)培養(yǎng)至3 天；供試品對(duì)照組中沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。 觀察菌落生長(zhǎng)情況，點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平板不宜計(jì)數(shù)。

點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)別兩個(gè)平板的菌落平均數(shù)不小于15,則兩個(gè)平板的菌落數(shù)不能相差1倍或以上。

試驗(yàn)組回收率計(jì)算 回收率計(jì)算試驗(yàn)組回收率計(jì)算的關(guān)鍵在于明確試驗(yàn)組與對(duì)照組的菌落數(shù)關(guān)系，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確；通過回收率驗(yàn)證，確保試驗(yàn)方法的可靠性和準(zhǔn)確性，為藥品微生物限度檢驗(yàn)提供有力支持。

計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果菌回收率計(jì)算公式：試驗(yàn)組的菌回收率在(0.5～2.0),照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的需氧菌、 霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率不在(0.5～2.0)范圍內(nèi)，應(yīng)采用 其他方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。方法適用性確認(rèn)時(shí)，若采用的上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到要求，那么選擇最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。

控制菌驗(yàn)證

驗(yàn)證菌株信息

大腸埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】

金黃色葡萄球菌（ Staphylococcus）【CMCC(B)26003】

乙型付傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】

菌株保藏要求 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。

菌液制備（以大腸埃希菌為例）

菌液制備方法 取1環(huán)大腸埃希菌新鮮TSA斜面培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。

菌液稀釋制備 分別取培養(yǎng)液 1ml加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7，制成每1ml含菌數(shù)10～100cfu的菌懸液。

驗(yàn)證過程（大腸埃希菌） 試驗(yàn)組：取1：10的供試液10ml加入濾杯，再加入1ml不大于100cfu的大腸埃希菌菌懸液過濾。最后再用300mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜（每次100ml，沖3次）。過濾結(jié)束后，將濾膜接種至裝有100mlTSB的無菌錐形瓶中。于30～35℃培養(yǎng)18-24h，觀察結(jié)果。取上述培養(yǎng)物1ml 接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基（MCB）中，42～44℃培養(yǎng)24小時(shí)，取麥康凱液體培養(yǎng)物劃 線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MCA）平板上30～35℃培養(yǎng)18小時(shí)。

菌液對(duì)照組：取10mlpH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試品，其余操作同試驗(yàn)組。

陰性對(duì)照組：取10mpH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試品，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

陰性對(duì)照組要求 試驗(yàn)組、菌液對(duì)照組應(yīng)檢出大腸埃希菌，陰性對(duì)照組應(yīng)未檢出試驗(yàn)菌，驗(yàn)證試驗(yàn)有效，否則應(yīng)消除供試品的抑菌活性重新驗(yàn)證。至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)。陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行該供試品控制菌的檢查。

未檢出試驗(yàn)菌處理 若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。

再驗(yàn)證

藥品組分變化 當(dāng)藥品的組分發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，需要進(jìn)行再驗(yàn)證。

檢驗(yàn)條件調(diào)整 當(dāng)驗(yàn)證時(shí)檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，需要進(jìn)行再驗(yàn)證。